最新研究成果 RDS，可体外抑制新冠、非典及乙型流感病毒感染

A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro

Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*

▋摘要

氛围：目前为止亦然蔓延全球的另行型冠状疾原疾 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个各内陆地区和内陆地区大风行，截至 2021 年 4 月末已导致少于 1.28 亿人疾菌，少于 280 万人失踪。现阶段，尚无可必要减低 COVID-19 无故率的疗程分析方法。我们研究者了一种习惯的里药制剂制剂——合于肺毒制剂液 (RDS) 的潜在外用冠状疾原已逝性，该制剂液主要掺入为----药理学习惯里使用疗程肺哮喘的里精油。

结果：RDS 消除 SARS-CoV 较慢疾原、SARS-CoV-2 较慢疾原、混合成亚型疾原-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 真型疾原以及传染性 SARS-CoV-2 和引申的 Ha-CoV-2 另行品种疾原 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对靶细胞质的疾菌。我们实质性说明了 RDS 可以实际上灭已逝 SARS-CoV-2 疾原微粒的传染性。此外，我们见到 RDS 还可阻绝亚型亚型对靶细胞质的疾菌。

推论：RDS 可广为消除消化道疾原疾菌。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状疾原，特异性疗程，合于肺毒制剂液，习惯里药，SARS-CoV，亚型流行性感冒，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 真型疾原

▋氛围

目前为止亦然蔓延全球的另行型冠状疾原疾 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个各内陆地区和内陆地区大风行，截至 2021 年 4 月末已导致少于 1.28 亿人疾菌，少于 280 万人失踪。现阶段，尚无可必要减低 COVID-19 无故率的疗程分析方法。另行单单现的 COVID-19 疾原寄生虫为冠状疾原 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在比较严重急性呼吸综合征方面冠状疾原种类里的姊妹疾原[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 以前都是在里国见到的；SARS-CoV 疾原于 2002 年 11 月末在广东省首次被见到[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 月末在武汉首次被见到[1,7,8]。在里国，这两次由冠状疾原招致的疫情里，里药均被广为可用，用以紧急应付冠状疾原招致的哮喘。对于现阶段的 COVID-19 大风行，里国有少于 85% 的 SARS-CoV-2 疾菌患者遵从了习惯里医药化学疗法（9，10）。许多可用的里药应该较强必要的外用冠状疾原特性并在诊断上应该必要，这个重要问题尚无得不到充分首肯。

里药作为疗程冠状疾原所引发哮喘的必要化学疗法，但由于考虑到体液或体外的系统研究者，其演进与充分可用均受到了阻碍。为了断定里药的潜在外用 SARS-CoV-2 已逝性，我们从常用里药里挑选了多种精油变种性，并从里药制剂液 RDS(美国一种各种类型食品补充剂) 里见到了外用 SARS-CoV 和外用 SARS-CoV-2 疾原的已逝性，一种在美国的商业社区活动食品补充剂。RDS 使用增强生理肺部的总体肥胖，其包不含多种精油掺入，如大豆和千里光，它们是习惯上使用依靠消化道和肺哮喘的里精油 (11-13)。在此，我们另行闻报道 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 真疾原以及较强疾菌性的野生型 SARS-CoV-2 疾原对靶细胞质的疾菌较强消除主导作用。我们实质性证明 RDS 可通过实际上灭已逝疾原微粒或阻挠疾原残余而消除疾原的更早疾菌工程进度。此外，我们见到 RDS 还可以阻挠甲流疾原对靶细胞质的疾菌。这些相比较，RDS 对消化道疾原的疾菌有可能较强广为的消除主导作用。

▋结果

为了从习惯里精油里找到潜在的外用 SARS-CoV-2 已逝性，我们从平均四十种习惯精油里挑选提取单单 SARS-CoV-2S 细胞真型较慢疾原[14,15] 和生理肺 A549(ACE2) 靶细胞质，此人类所 ACE2 基因就会通过较慢疾原转导作为多种类型内皮细胞，从而稳定转导来实现的大传达。较慢真型疾原可用黄色荧光细胞 (GFP) 或荧光亦同酶 (Luc) 作为另行闻报道基因，并通过了较强广谱特异性转至消除剂，以及贝拉巴格 (Arbidol)[16]，和人类所外用毒血清对外用 SARS-CoV-2(上图 1a、C) 的验证。我们并能成功鉴定到贝拉巴格 (Arbidol) 和外用毒血清对于 SARS-CoV-2 真型疾原的消除主导作用，这是我们在其他四十余种习惯精油变种性飞行测试里没见到的，还包括其里一些依赖于较高刺激性的精油 (上图 1a-C)。然而，鉴于较慢性真型疾原仅能鉴定 SARS-CoV-2 疾原的残余行为，我们不就会排除这些精油变种性有可能有在转至后收尾并能消除 SARS-CoV-2 的有可能。我们实质性从习惯用药合于肺毒制剂液 (RDS) 里挑选单单了有可能的外用 SARS-CoV-2 已逝性，该厂商不所含大类精油掺入——、连翘、大豆、千里光、柴胡、苦杏仁、蜂房、皂角、冬瓜，在里国习惯上使用疗程肺哮喘 (11-13)。

不所含氨基咖啡胺、3，4-二邻咖啡酰基苯酚胺、氨基 3，4-二邻咖啡酰基苯酚胺、原儿茶胺、氨基绿原胺和木棉草亦同；初夏里还不所含衍动物 A、B 和 10 种已知环烯醚羟基类衍动物[17]；该变种还不所含皂甙甙 A 和 B，以及外用消化道主导作用的衍动物 C[18,19]。连翘酯衍动物里不所含木脂亦同、松脂酚连翘衍动物[20]。大豆里不所含被统称大豆皂衍动物的甾体皂衍动物，是大豆属变种独有的变种化学物质[21,22]。细叶千里光里主要已逝性掺入为四种单羟基类，(−)-薄荷氨基、(+)-弗莱格氨基、(−)-柠檬烯和 (+)-薄荷甲苯；这种变种还不所含其他锂，如 1-辛烯-3-羟基、3-辛氨基、β-月末桂烯和β-石竹烯[23]。柴胡不所含少于 162 种锂，还包括环烯醚羟基类和环烯醚羟基类衍动物、苯丙衍动物、有机胺、羟基类、糖类、黄氨基类、和皂衍动物[24]。苦杏仁里不所含酚类、丙酮锂和水溶性多糖[25]。皂角刺里不所含皂衍动物和羽扇豆胺[26,27]，而冬瓜里不所含主要已逝性掺入冬瓜胺[28]。为了实质性飞行测试 RDS 的外用 SARS-CoV-2 已逝性，用不同气态剂量的 RDS 预所在位置理 A549(ACE2) 细胞质，然后让这些细胞质在依赖于 RDS 的前提遵从 4-6 每隔的疾菌。疾菌后，在不依赖于 RDS 的前提养成细胞质，然后在 48 和 72 每隔的时候，通过流式细胞质练成对疾原疾菌的消除主导作用透过计量。为了依靠细胞质刺激性，可用锰丙啶 (PI) 对即将失踪和已失踪的细胞质透过切片，仅在已逝细胞质群里计量 GFP+细胞质。如上图 2 请注意，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 真疾原较强静脉注射选择性消除主导作用。为了推测这些结果，我们可用内源性传达 ACE2 的 VeroE6 细胞质反复了该疾菌物理。

(见下页上图)

ACE2 内部传达，生产性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 疾原可对其透过疾菌，ACE2 通常使用冠状疾原的研究者 (7)。顾及在考虑到 ACE2 的大传达 [15，29，30] 的前提，真型疾原对 VeroE6 的疾菌性较差，我们还可用了荧光亦同酶另行闻报道基因真型疾原，该疾原的另行闻报道基因传达由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，较强更高的另行闻报道基因敏感度和信噪比。

上图 2：RDS 消除 SARS-CoV-2(GFP) 真型疾原疾菌 A549(ACE2) 细胞质。

A.A549(ACE2) 细胞质用 RDS 整年气态 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 真型疾原疾菌。将细胞质浸去疾原和 RDS，并在不依赖于 RDS 的前提透过养成。流式细胞质星象鉴定疾原疾菌消除状况。没疾菌的细胞质和疾菌 SARS-CoV-2(GFP) 但不经 RDS 疗程的细胞质作为对照。GFP+细胞质平均值已推断。(PI) 锰丙啶。

B.RDS 的细胞质刺激性定量计量。A549(ACE2) 细胞质用 RDS 整年气态 4 每隔，浸去 RDS，无 RDS 养成 48 每隔。锰丙啶切片鉴定亦然试上图失踪细胞质和已失踪细胞质，流式细胞质练掺入析。绘单单静脉注射-自由基细胞质刺激性斜率，RDS 的半无故剂量 (LC50) 分之一为 1:11.9。

如上图 3A 请注意，我们可用 Luc 报告基因真疾原和 VeroE6 细胞质透过疾菌物理，捕捉到到 RDS 对该疾原疾菌较强静脉注射选择性消除主导作用，并且总数消除剂量断定为 1:230RDS 气态度 (上图 3B)。我们还计量了 RDS 对 VeroE6 细胞质已逝力的影响，断定了 50% 细胞质失踪静脉注射为 1:11.8RDS 气态度。

上图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 真疾原和野生型 SARS-CoV-2 疾原的静脉注射选择性消除消除主导作用。用 RDS 整年气态预所在位置理 A、BVeroE6 细胞质，并用 SARS-CoV-2(Luc) 真型疾原疾菌。将细胞质浸去疾原和 RDS，并在不依赖于 RDS 的前提透过养成。在疾菌后 72 每隔用荧光亦同酶鉴定疾原疾菌的消除主导作用。没疾菌细胞质和 SARS-CoV-2-luc 疾菌但不经过 RDS 疗程的细胞质作为对照。物理反复三次。绘单单静脉注射自由基斜率和 RDS 的 I-C50 气态分之一为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞质的细胞质刺激性也通过锰丙啶切片和流式细胞质练成定量计量。用 RDS 整年气态 4 每隔，浸去 RDS，在不不含 RDS 的前提养成 72 每隔。绘单单细胞质刺激性静脉注射-自由基斜率，RDS 的半无故剂量 (LC50) 分之一为 1:13.8 气态。DRDS 消除传染性 SARS-CoV-2 疾菌。用整年气态的 RDS 预所在位置理 VeroE6 细胞质，并在 RDS 依赖于的前提疾菌 SARS-CoV-2。疾菌 48 每隔后，通过血菌斑计量疾原无罪释放后的疾原粘贴消除状况。消除试验一式二分透过，并在 Prism7(Graph Pad) 里可用单向方差 (One-Way ANOVA) 计量及 Dunnett 后鉴定 (Dunnett's Post Test)，为了将断定总和显着性。显著性值用则有表示如下：*p

为了实质性验证可用真疾原赢取的结果，我们飞行测试了 RDS 对于 SARS-CoV-2 疾菌的阻绝传染性能力。如上图 3D 请注意，RDS 同时也阻绝了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞质的疾菌。RDS 在气态 1:40 以上时可显著减少疾原斑纹的形成。

综上，通过 SARS-CoV-2 真疾原与传染性疾原的相比较，RDS 不所含消除 SARS-CoV-2 疾菌的已逝性掺入，有可能是通过实际上灭已逝疾原或阻绝疾原的更早疾菌工程进度。

为实质性研究者有可能的功能，我们将传染性 SARS-CoV-2 疾原微粒与整年气态的 RDS 在 37°C 下预养成 1 每隔。随后，将气态实质性依次气态-(10–1 至 10–4)，并自组 Vero 细胞质透过血菌斑计量以断定疾原疾菌性的减低。如上图 4A 请注意，我们捕捉到到在 RDS 里在此之后暴露一每隔后的疾原微粒，其 SARS-CoV-2 的疾菌效价也黄黄色静脉注射选择性回升。该结果推测了 RDS 可必要实际上灭已逝 SARS-CoV-2 疾原微粒的传染性。

我们实质性飞行测试了 RDS 应该也能消除 SARS-CoV-2 疾原另行品种的疾菌。为此，我们利用在在开发的混合成甲疾原-SARS-CoV-2 真型疾原 (Ha-CoV-2)[31] 来合成一三部 S 细胞值得注意，还包括英美值得注意 (B.1.1.7)，尼日利亚值得注意 (B.1.351)，巴西值得注意 (P.1)，北卡罗来纳州值得注意 (B.1.429)，和其他几个另行兴值得注意 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和方面 S 细胞个体差异体在 37°C 整年气态 RDS 养成 1 每隔。随后，用该气态疾菌 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶细胞质。疾菌后 12 每隔，荧光亦同酶精确测量疾原疾菌的消除主导作用。如上图 4B 请注意，我们还捕捉到到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 细胞值得注意的静脉注射选择性消除。

我们还飞行测试了 RDS 阻绝 SARS-CoV 疾菌的能力，可用十分相似 SARS-CoV 突刺细胞的 GFP 另行闻报道基因较慢疾原和[15] 实为静脉注射。我们将人 A549(ACE2) 细胞质当作靶细胞质，将其用三部气态的 RDS 预所在位置理，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因真疾原疾菌 4-6 每隔。疾菌后在不不含 RDS 的前提养成细胞质，流式细胞质练成计量鉴定其对疾原疾菌的消除主导作用。举例来说，可用锰丙啶排除亦然试上图失踪与已失踪的细胞质，仅在已逝细胞质群里计量 GFP+细胞质。如上图 5A 请注意，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 真型疾原的消除主导作用黄黄色静脉注射选择性。我们实质性推测了这些结果，并计量了 RDS 内皮细胞的消除与 Luc 另行闻报道基因 SARS-CoV 真型疾原，SARSCoV(Luc)。我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的消除主导作用黄黄色静脉注射性依赖，其半消除剂量 (IC50) 为 1:70.88 气态度 (上图 5B，C)。顾及 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都可用 ACE2 疾菌靶细胞质，我们还飞行测试了 RDS 的特异性已逝性应该仅针对与 ACE2 有相互主导作用的冠状疾原。为此，我们鉴定了一种不方面的负链 RNA 疾原---亚型亚型。它通过疾原血凝亦同 (HA) 和细胞质α-唾液胺来疾菌靶细胞质。为了合成亚型亚型，将传达亚型流行性感冒 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个影片的 8 个多种类型和一个 GFP-另行闻报道基因共转染到 HEK293T 细胞质里。在 RDS 依赖于的前提，利用疾原微粒并使用疾菌能够 MDCK 细胞质。如上图 6A 请注意，我们捕捉到到 RDS 对亚型亚型的消除主导作用黄黄色静脉注射选择性。RDS 在 1:40 和 1:80 气态时可全然阻绝疾原疾菌，在 1:160 气态时是可部分消除亚型流行性感冒。RDS 对 MDCK 细胞质的半无故剂量 (LC50) 经精确测量为 1:18.5(上图 6B)。这些相比较，RDS 的特异性已逝性并非针对特定疾原，而有可能并能广为消除多种消化道疾原，如冠状疾原和亚型亚型。

▋讨论

在本报告里，我们说明了习惯用药合于肺毒制剂液 (RDS) 不所含广谱特异性已逝性，可阻绝 SARS-CoV、SARSCoV-2 和亚型亚型的疾菌。虽然 RDS 并能消除多种疾原，但其特异性已逝性因疾原类型和亚型而异。例如，对 SARS-CoV 较慢真疾原的 I-C50 剂量为 1:7.9 气态度，对 SARS-CoV-2 较慢真疾原的 I-C50 剂量为 1:230 气态度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 疾原，I-C50 为 1:40 气态度，对亚型流行性感冒，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其另行品种有不同的消除主导作用，IC50 最大值从 1:70 到 1:2601 气态度不等 (上图 4B)。

(见下一页上图)

上图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和引申的 Ha-CoV-2 另行品种较强静脉注射选择性灭已逝主导作用。ASARS-CoV-2 微粒延整年气态的 RDS 在 37°C 下养成 1 每隔。随后，将气态实质性整年气态，并自组 Vero 细胞质里透过血菌斑计量，以断定疾原疾菌性减低。消除试验一式二分透过，并在 Prism7(GraphPad) 里可用单向方差 (One-WayANOVA) 计量和 Dunnett 后鉴定 (Dunnett'sPostTest) 为了将断定总和显着性。显著性值用则有表示如下：*p

BHa-CoV-2(Luc) 和方面 S 细胞值得注意与整年气态的 RDS 在 37°C 养成 1 每隔后，用气态疾菌 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶细胞质。疾菌后 12 每隔，荧光亦同酶精确测量疾原疾菌的消除主导作用。RDS 的 IC50 值的气态度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。

我们实质性说明了 RDS 可以消除冠状疾原的更早疾菌工程进度。虽然具体的特异性功能尚无清楚，但 RDS 可以通过实际上灭已逝疾原微粒或通过阻挠疾原残余或阻绝疾原残余后的更早工程进度来阻挠疾原疾菌。在其他几种习惯里药里也见到了外用 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的已逝性。例如，一种常见的习惯里药——冬瓜。

冬瓜根里已证明不所含冬瓜胺亦同，诱发 SARS 疾原[32] 诊断受控株的粘贴。此外，另一种可使用疗程消化道哮喘的里药——双黄连制剂，已推断单单在体外以静脉注射选择性方式则消除 SARS-CoV-23CL 细胞酶 (3CLpro) 已逝性。龙胆衍动物和龙胆亦同拟作为双黄连阻绝 3CLpro[33] 的必要掺入。

上图 5 RDS 消除 SARS-CoV 真型疾原对 A549(ACE2) 细胞质的疾菌。用整年气态的 RDS 预所在位置理 A、B 细胞质，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 真型疾原疾菌。将细胞质清浸，去掉疾原和 RDS，在不依赖于 RDS 的前提透过养成。在疾菌后 48 每隔和 72 每隔，通过流式细胞质练成或荧光亦同酶鉴定来定量计量疾原疾菌的消除主导作用。物理反复三次。绘单单静脉注射号召斜率，并绘单单 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 气态度 (C)

上图 6 RDS 消除甲流疾原对 MDCK 细胞质的疾菌。(A) 用整年气态的 RDS 预所在位置理 MDCK 细胞质 30 分钟，然后用甲流疾原 (GFP) 对其透过疾菌。疾菌后，在 RDS 依赖于下养成细胞质。36 每隔后用流式细胞质星象对疾原疾菌的消除主导作用透过定量计量。把没疾菌的细胞质与被甲流疾原 (GFP) 疾菌但不经 RDS 所在位置理的细胞质透过对比。上图里推断了 GFP+细胞质的平均值。PI 表示锰丙啶 PI。

(B) 另外还可用了 MTT 精确测量法定量计量了 RDS 对 MDCK 细胞质的刺激性，绘单单了细胞质刺激性的静脉注射-自由基斜率，经近似值，RDS 的总数无故剂量为 1:18.5 气态度 RDS 的必要特异性掺入尚无断定。然而，RDS 不同于龙胆衍动物和龙胆亦同，RDS 可以通过实际上灭已逝疾原原子核来阻绝疾原疾菌 (上图 4)，而龙胆衍动物和龙胆亦同则在疾原可持续的早期通过阻绝疾原细胞酶的已逝性来依赖于。然而，RDS 的体外外用 SARS-CoV-2 已逝性仍需在无论如何的鸟类研究者和人类所诊断试验里得不到推测。目前为止，我们亦然试上图透过小型鸟类物理，以断定 RDS 在体液阻绝 SARS-CoV-2 疾原疾菌的潜力。

▋推论

我们的研究者声称，RDS 可广为消除消化道疾原的疾菌，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和亚型流行性感冒。

▋分析方法

细胞质和细胞质养成

HEK293T (ATCC 巴里米尔，宾夕法尼亚州) MDCK (ATCC 巴里米尔，宾夕法尼亚州)，VeroE6 (ATCC 巴里米尔，宾夕法尼亚州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赠予，巴里米尔，宾夕法尼亚州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赠予，巴里米尔，宾夕法尼亚州) 目前为止保存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔科技领域 Thermo Fisher Scientific) 不所含 10% 热灭已逝 FBS 和 1×制剂-阿司匹林 (赛默飞世尔科技领域 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞质养成基里分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的剂量自组嘌呤霉亦同和潮霉亦同 B。

质粒转染和疾原合成

不含 SARS-CoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的较慢性真型疾原微粒由 Virongy LLC (Manassas，VA) 缺少，或按照左边描绘的分析方法[15] 合成。简言之，为了合成 GFP 另行闻报道基因较慢性真疾原，HEK293T 细胞质与传达 SARS-CoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的多种类型、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了产单单荧光亦同酶另行闻报道基因较慢性真型疾原，将 HEK293T 细胞质与传达 SARSCoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的多种类型、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 透过共转染。转染后 48 每隔利用疾原上清液，离心混和，−80℃ 保存。野生型 SARS-CoV-2 疾原 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 缺少。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因质粒和 A/WSN/1933 H1N1 引申质粒 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 博士友善缺少。在亚型 A-GFP 另行闻报道基因原子核合成里，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 细胞质 (ΔAT6)。48 每隔后利用疾原上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 传达多种类型自产 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 多种类型和 S 细胞个体差异多种类型。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞个体差异原子核按照左边描绘分析方法[31] 透过合成。

疾原疾菌和用药消除试验

RDS(合于肺毒制剂液)(来自 Dejia Harmony 赠予，利斯堡，宾夕法尼亚州) 是由马在博士物理室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商业社区活动厂商。RDS 里所有里精油掺入均符合《里国药典 2015 年版》「饮片」规范，还包括必要掺入不含量及重金属、除草剂预购鉴定。RDS 是一种里药的共煎剂，最后副产物在密闭条件下蒸发。SARS-CoV-2 外用血清由 LanceA. Liotta 医生缺少。将贝拉朵尔盐胺盐 (Sigma) 重另行微粒在二氨基亚砜 (Sigma) 里。对于真型疾原疾菌，12 孔板里的 A549(ACE2) 细胞质 (来自 Virongy LLC 赠予，巴里米尔，宾夕法尼亚州) 或 VeroE6 细胞质用 RDS 预所在位置理 30 分钟，在 37℃ 下疾菌 4-6 每隔，然后在另行鲜养成基里浸涤养成 48-72 每隔。对于 VeroE6 细胞质的疾菌，细胞质也被 CoV-2 真型疾原疾菌增强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赠予，巴里米尔，宾夕法尼亚州) 预所在位置理后，在 37°C 下再所在位置理 30 分钟。可用 GloMaxDiscover 酶标星象 (Promega) 计量细胞质裂解物的荧光亦同酶已逝性。对于野生型 SARS-CoV-2 疾菌，VeroE6 细胞质在 37°C 下用 RDS 预所在位置理 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 疾菌 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在乔治汤普森私立大学的 BSL-3 养老院设施内停留 1 每隔。细胞质用 PBS 浸涤 2 次，用不含 RDS 的养成基养成 48 每隔。从上清里提取疾原，用 12 孔板养成的 Vero 细胞质单层里的血菌斑试验精确测量小瓶滴度。简言之，每个塑料在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 养成基 (VWR) 里合成，包不含 1X 制剂-阿司匹林 (VWR)，并添延 10% 的 FBS(赛默飞世尔科技领域 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种气态液微粒到 VeroE6 细胞质单层的三个平行孔上 1 每隔。然后用 1～2 ml0.6% 粘液糖 (Invitrogen) 和一部分完整的 Eagle Minimal Essential 养成基 (VWR) 的气态遮盖单层，不含 1X 制剂-阿司匹林，并添延 10%FBS。48 每隔后，将单层膜通常在 10% 甲醛混合物里 1 每隔，并转化成遮盖的粘液库姆。为了切片斑纹，自组不所含 20% 乙羟基的 1% 沉淀紫染料混合物 5 分钟，然后用去离子水浸涤。对于亚型亚型疾菌 MDCK 细胞质，在 37°C 下用 RDS 预所在位置理 30 分钟，然后用 A-GFP 另行闻报道基因疾原疾菌 6 每隔。用不含 RDS 的养成基浸涤细胞质，养成 36 每隔。GFP 传达通过流式细胞质星象定量计量。(FACSCalibur，BD Biosciences).

对于 SARS-CoV-2 疾原微粒的 RDS 灭已逝试验，将 100μl 整年气态的 RDS 添延到 1 mlSARS-CoV-2 疾原原液 (3.65×105PFU/ml) 里，最后 RDS 气态为 1:20，1:40 或 1:80。也还包括对照条件 (1 ml 疾原+100μl 养成基)。气态在 37°C 下养成 1 每隔。随后，对气态透过三部气态以归因于额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 气态度，并将整年气态的塑料自组 12 孔板里的 Vero 细胞质里，使用透过血菌斑精确测量计量。斑纹精确测量里最后的 RDS 气态度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 气态液。

Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞个体差异原子核按照左边描绘的分析方法[31] 合成。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭已逝，将 5μl 整年气态的 RDS 添延到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或值得注意里，最后 RDS 气态度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将气态在 37°C 下养成 1 每隔，然后在 RDS 依赖于下疾菌 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞质 12 每隔。可用 GloMax Discover 酶标星象 (Promega) 计量细胞质裂解物的荧光亦同酶已逝性。

细胞质刺激性计量鉴定

用锰丙啶切片和流式细胞质练成计量对 A549 (ACE2) 细胞质和 VeroE6 细胞质的用药细胞质刺激性透过鉴定，如说明了 (34)。可用细胞质增殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商建议的可行性对 MDCK 细胞质的用药刺激性透过计量。简言之，将 MDCK 细胞质 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞质的速度牛痘到 12 孔板里。细胞质养成隔夜后，通过 RDS 所在位置理 1 天，然后在 MTT 标有试剂 (Sigma) 的养成基里养成。将细胞质与标有试剂协力养成 4 每隔，再近期自组 MTT 增混合物。养成皿孵育投宿，用 GloMax Discover 酶标星象 (Promega) 精确测量吸光度。

英文

SARS-CoV：比较严重急性肺部症候群方面冠状疾原；SARSCoV-2：Severe 比较严重急性肺部症候群方面冠状疾原-2；TCM：习惯里药；RDS：消化道排毒制剂液；Ha-CoV-2：混合成亚型另行冠疾原真疾原。

致谢

表示感谢 FengLi 缺少亚型传达多种类型，表示感谢 LanceLiotta 缺少外用毒血清；表示感谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与建议；表示感谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 缺少 RDS 和精油变种性。

作者重大贡献

此次物理由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 另行设计，由 Y.W. 主笔，由 L.A.H. 总编。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 继续执行了该物理。所有作者已阅读并批准最后文稿。

资金

本研究者的经费来自于乔治汤普森私立大学内部拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该赔偿金由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 缺少。

原始数据和塑料的可用性

本研究者里归因于或计量的所有原始数据均包不含在本文里。试剂可从 Y.W 所在位置获取。

声明

批准及进行首肯

不原则上

首肯单单版

不原则上

恶性竞争各内陆地区主权

乔治汤普森私立大学各内陆地区动物防卫和结核疾里心的 RMH 和 YW 已赢取了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的研究者资助，LAH 为德佳和畅出任顾问并赢取了应得。没其他人关系或已逝动有可能就会影响到提交的工作。

作者详细信息

1美国宾夕法尼亚州乔治汤普森私立大学动物化学学院各内陆地区动物防卫和结核疾里心，巴里米尔 20110。

2VirongyLLC，宾夕法尼亚州巴里米尔。3延拿大安纳比，BCV5J0E5 马在博士物理室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 美国宾夕法尼亚州利斯堡世界卫生科学民间组织，20176。

收稿日期：2021 年 4 月末 7 日

遵从日期：2021 年 5 月末 10 日

线上单单版时间段：2021 年 5 月末 29 日

注释

1. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, et al. A Novel Coronirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020;382(8):727–33.

2. Wu Y, Ho W, Huang Y, Jin D, Li S, Liu S, et al. SARS-CoV-2 is an appropriate name for the new coronirus. Lancet. 2020;395(10228):949–50.

3. Gorbalenya AE, Baker SC, Baric RS, de Groot RJ, Drosten C, Gulyaeva AA, et al. Coroniridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Nat Microbiol. 2020;5:536–44.

4. Drosten C, Günther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt H-R, Becker S, et al. Identification of a novel coronirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1967–76.

5. Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, et al. A novel coronirus associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1953–66.

6. Peiris JSM, Lai ST, Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, et al. Coronirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet. 2003;361(9366):1319–25.

7. Zhou P, Yang X-L, Wang X-G, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270–3.

8. Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y-M, Wang W, Song Z-G, et al. A new coronirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020;579(7798):265–9.

9. Yang Y, Islam MS, Wang J, Li Y, Chen X. Traditional Chinese medicine in the treatment of patients infected with 2019-new coronirus (SARS-CoV-2): a review and perspective. Int J Biol Sci. 2020;16(10):1708–17.

10. Ling CQ. Traditional Chinese medicine is a resource for drug discovery against 2019 novel coronirus (SARS-CoV-2). Journal Integr Medicine. 2020;18(2):87–8.

11. Shan M-Q, Qian Y, Yu S, Guo S-C, Zhang L, Ding A-W, et al. Anti-inflammatory effect of volatile oil from Schizonepeta tenuifolia on carrageenininduced pleurisy in rats and its application to study of appropriate harvesting time coupled with multi-attribute comprehensive index method. J Ethnopharmacol. 2016;194:580–6.

12. Jung ID, Kim HY, Park JW, Lee CM, Noh KT, Kang HK, et al. RG-II from Panax ginseng C.A. Meyer suppresses asthmatic reaction. BMB Reports. 2012;45(2):79–84.

13. Wu W, Li R, Li X, He J, Jiang S, Liu S, et al. Quercetin as an antiviral agent inhibits influenza A virus (IAV) entry. Viruses. 2015;8(1):6. doi. org/

10. 3390/ v8010 006. 14. Belouzard S, Chu VC, Whittaker GR. Activation of the SARS coronirus spike protein via sequential proteolytic cleage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(14):5871–6.

15. He S, Waheed AA, Hetrick B, Dabbagh D, Akhrymuk IV, Kehn-Hall K, et al. PSGL-1 inhibits the incorporation of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike glycoproteins into pseudovirus and impairs pseudovirus attachment and infectivity. Viruses. 2021;13(1):46. doi. org/ 10. 3390/ v1301 0046.

16. Boriskin YS, Leneva IA, Pecheur EI, Polyak SJ. Arbidol: a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion. Curr Med Chem. 2008;15(10):997–1005.

17. Kakuda R, Imai M, Yaoita Y, Machida K, Kikuchi M. Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera japonica. Phytochemistry. 2000;55(8):879–81.

18. Son KH, Jung KY, Chang HW, Kim HP, Kang SS. Triterpenoid saponins from the aerial parts of Lonicera japonica. Phytochemistry. 1994;35(4):1005–8.

19. Kwak WJ, Han CK, Chang HW, Kim HP, Kang SS, Son KH. Loniceroside C, an antiinflammatory saponin from Lonicera japonica. Chem Pharm Bull. 2003;51(3):333–5.

20. Din LB, Bedgar DL, Katayama T, Lewis NG. On the stereoselective synthesis of (+)-pinoresinol in Forsythia suspensa from its achiral precursor, coniferyl alcohol. Phytochemistry. 1992;31(11):3869–74.

21. Kim YS, Woo JY, Han CK, Chang IM. Safety ysis of panax ginseng in randomized clinical trials: a systematic review. Medicines. 2015;2(2):106–26.

22. Attele AS, Wu JA, Yuan CS. Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions. Biochem Pharmacol. 1999;58(11):1685–93.

23. Yu S, Chen Y, Zhang L, Shan M, Tang Y, Ding A. Quantitative comparative ysis of the bio-active and toxic constituents of lees and spikes of Schizonepeta tenuifolia at different harvesting times. Int J Mol Sci. 2011;12(10):6635–44.

24. Ren D, Shen Z-y, Qin L-p, Zhu B. Pharmacology, phytochemistry, and traditional uses of Scrophularia ningpoensis Hemsl. J Ethnopharmacol. 2021;269:113688.

25. Sefer F, Misirli A, Gülcan R, editors. A RESEARCH ON PHENOLIC AND CYANOGENIC COMPOUNDS IN SWEET AND BITTER KERNELLED APRICOT VARIETIES. 2006: International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium.

26. Chong W, Feng XY, Zhen GZ, Dan L, Yue D. Inhibition of mast cell degranulation by saponins from Gleditsia sinensis–structure-activity relationships. Nat Prod Commun. 2009;4(6):777–82.

27. Li WH, Zhang XM, Tian RR, Zheng YT, Zhao WM, Qiu MH. A new anti-HIV lupane acid from Gleditsia sinensis Lam. J Asian Nat Prod Res. 2007;9(6–8):551–5.

28. Nazari S, Rameshrad M, Hosseinzadeh H. Toxicological effects of Glycyrrhiza glabra (Licorice): a review. Phytother Res. 2017;31(11):1635–50.

29. Meltzer B, Dabbagh D, Guo J, Kashanchi F, Tyagi M, Wu Y. Tat controls transcriptional persistence of unintegrated HIV genome in primary human macrophages. Virology. 2018;518:241–52.

30. Wang Z, Tang Z, Zheng Y, Yu D, Spear M, Iyer SR, et al. Development of a nonintegrating Rev-dependent lentiviral vector carrying diphtheria toxin A chain and human TRAF6 to target HIV reservoirs. Gene Ther. 2010;17(9):1063–76.

31. Hetrick B, He S, Chilin LD, Dabbagh D, Alem F, Narayanan A, et al. Development of a novel hybrid alphirus-SARS-CoV-2 particle for rapid in vitro screening and quantification of neutralization antibodies, viral variants, and antiviral drugs. bioRxiv 2020. doi. org/ 10. 1101/ 2020. 12. 22. 423965.

32. Cinatl J, Morgenstern B, Bauer G, Chandra P, Rabenau H, Doerr HW. Glycyrrhizin, an active component of liquorice roots, and replication of SARS-associated coronirus. Lancet. 2003;361(9374):2045–6.

33. Su H-x, Yao S, Zhao W-f, Li M-j, Liu J, Shang W-j, et al. Anti-SARS-CoV-2 activities in vitro of Shuanghuanglian preparations and bioactive ingredients. Acta Pharmacologica Sinica. 2020;41(9):1167–77.

34. Crowley LC, Scott AP, Marfell BJ, Boughaba JA, Chojnowski G, Waterhouse NJ. Measuring cell death by Propidium Iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2016. doi. org/ 10. 1101/ pdb. prot0 87163.